【前沿进展】Nature | 刘彬/薛文/Sontheimer团队开发 Prime Assembly，实现最大 11 kb 基因组大片段精准插入

背景：基因治疗的核心挑战之一是将大于1kb的DNA片段精准插入基因组而不引入双链断裂（DSB）。现有方法如NHEJ/HDR存在随机插入和毒性，而PE相关工具在大于400bp插入时效率显著下降。目的：开发一种不依赖DSB、整合酶或HDR的大片段基因组精准插入策略。方法：研究者提出Prime Assembly（PA），利用twin prime编辑产生的单链flap与线性双链DNA供体互补，通过细胞内源修复机制实现拼接。研究使用PE6c、twin-epegRNA及PCR制备的线性供体，结合DNA-PK抑制、3′悬挂单链供体（odsDNA）、多片段拼装等技术优化效率与精准性。结论：PA在HEK293T细胞中成功实现0.1kb至11kb的精准插入，0.8kb供体插入效率最高达50%，且无需DSB、整合酶或质粒。关键验证包括11.3kb DMD cDNA和2.4kb CD19 CAR-P2A-GFP的精准整合。全基因组分析显示高度位点特异性。PA提供了一条高效、精准且简便的大片段基因插入新路径，为非病毒体内递送奠定基础，但机制阐明和安全性评估仍需进一步研究。