Nature | 刘彬/薛文/Sontheimer团队开发 Prime Assembly，实现最大 11 kb 基因组大片段精准插入

本研究开发了一种名为Prime Assembly（PA）的新型基因组大片段精准插入技术，解决了基因治疗中长片段DNA高效、精准插入的难题。背景方面，现有基因编辑方法依赖双链断裂（DSB）或整合酶，存在随机插入、免疫原性及递送效率低等局限性，且>400 bp的插入效率显著下降。研究目的旨在探索一种无需DSB、重组酶或同源定向修复的精准大片段插入策略。结论显示，PA利用twin prime editing生成的单链flap与线性双链DNA供体互补，通过细胞内源修复机制实现0.1-11 kb的精准插入，对0.8 kb供体效率最高达50%。技术优化包括DNA-PK抑制提升效率、3′悬挂单链供体提高精准度、多供体细胞内拼装突破AAV递送限制。成功案例包括11.3 kb DMD cDNA精确插入AAVS1位点及2.4 kb CAR-T构建体整合至TRAC位点。全基因组分析证实PA高度位点特异性。PA具有无DSB、无整合酶、无质粒、供体可PCR制备等特点，为基因治疗的非病毒体内递送奠定基础，但体内应用仍需进一步评估DNA-PK抑制安全性与递送体系。